鸟枪法测序

1. 鸟枪法测序的操作方法

1) 用限制酶切下目的片段的大片段Insert DNA，并用Agarose凝胶电泳进行回收。
2) 对回收的大片段DNA用物理方法（如超声波等）进行切断处理，然后用T4 DNA Polymerase 对小片段DNA进行末端平滑化。
3) 进行Agarose 电泳，切胶回收1-2kbp的小片段DNA。然后用Bca Best DNA Ploymerase在DNA的3’端加上一个A碱基。
4) 把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。
5) 对阳性克隆（含1-2kbp）进行DNA测序。
6) 对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。

2. DNA测序量

如果测4重反应，应该进行的测序量以DNA片段实际长度的4倍量进行计算，对每个反应的有效测序长度定义为800bp。
2如：对10kbp的DNA片段进行测序时，可以按以下方法进行计算： 测序量＝10,000Bases*4/800Bases=50个反应

3. 结果编辑

按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序，然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段 (Contig)。

4. 补缺工作

结果编辑工作结束后，会发现在数个DNA大片段 (Contig) 间的序列没有测定，此时应该进一步通过技术手段，解析那些没有被解明的DNA序列，进行整体DNA序列的补缺工作。

5. 其它说明

病毒DNA中，特别是病毒DNA的两端经常会有大片段的DNA重复序列出现，可能无法测序，请理解。
DNA序列中，有时会有G、A、C、T的连续结构、G/C rich等复杂的立体结构出现，此部分有可能无法测序，请理解。

限制酶切，亚克隆测序法

1. 测序方法

由于鸟枪法测序会出现较多的重复测序结果，因此，小于100 kbp的DNA片段测序工作使用鸟枪法测序价格太昂贵，此时比较适合于使用限制酶切、亚克隆测序法。
限制酶切、亚克隆测序法的方法如下：

1) 选择适当的限制酶，对Insert DNA片段进行切断处理。
2) 对切断的DNA片段进行亚克隆。
3) 对每个亚克隆中的DNA片段进行测序。
4) 编辑测序结果。
5) 整体序列如有空缺，进行补缺工作。